Buitenbeentje Peter (Andrew Garfield) probeert het mysterie van zijn eigen verleden te ontrafelen en het hart van zijn vlammetje op school Gwen Stacy (Emma Stone) te winnen. Een mysterieus koffertje van zijn vader, die hem als kind verliet, leidt Peter naar Dr. Connors, zijn vaders voormalige collega. De onthulling van zijn vaders geheim geeft gestalte aan Peters lot als "Spider-Man", die het zal moeten opnemen tegen Connors kwaadaardige alter ego, de Lizard.